关节软骨有望成为首批被成功修复的工程组织之一，但目前软骨修复产品很少，而且有相当大的局限性。例如，在全球上市的基于细胞的产品中，只有一种用于非膝关节适应症，没有一种用于严重的骨关节炎或类风湿性关节炎。不过，软骨组织工程学的进步现在可能会带来新的软骨修复产品的开发。
为了解这一领域的潜力，来自美国加利福尼亚大学尔湾分校的Kyriacos A. Athanasiou团队综述了目前用于关节软骨修复的组织工程产品，尤其是基于细胞的疗法。细胞来源、生物活性刺激物和支架或无支架方法方面的进展应有助于治疗开发的进展。由于受骨关节炎或类风湿性关节炎影响的关节需要植入物来抵御免疫挑战，因此需要针对炎症环境进行工程设计。要将更多软骨修复产品推向市场，就必须了解其商业化的转化载体。迄今为止取得的进展可以促进工程软骨产品的未来转化，使数百万软骨损伤和关节炎患者受益。相关工作以题为“Recent advancements in cartilage tissue engineering innovation and translation”的综述文章发表在2024年05月13日的国际顶级期刊《Nature reviews rheumatology》。
【本文亮点】
· 在全球上市的以细胞为基础的关节软骨产品中，只有一种用于非膝关节适应症，没有一种用于严重骨关节炎，也没有一种用于类风湿性关节炎。
· 软骨组织工程学的进展包括制造基于支架和不含支架的软骨，这些软骨具有强大的机械性能，可以使植入物在负载关节环境中存活。
· 通过使用免疫调节生物材料和合成生物学，组织工程软骨植入物能够在炎症环境中存活下来，这是当前的研究重点。
· 大多数膝关节软骨组织工程大动物研究使用猪、山羊和绵羊模型，而颞下颌关节研究则使用猪模型。
· 临床开发中的一些组织工程软骨产品使用异体细胞来源；使用异体细胞的细胞库可以提高可重复性和一致性。
· 由于生物制剂转化的艰巨性，学术研究人员应熟悉转化载体（包括监管、生产、资金和知识产权方面），以促进临床开发。
1. 内容
本综述详细介绍了过去十年（重点是过去五年）在关节软骨组织工程学方面取得的进展，这些工程学用于膝关节、髋关节、TMJ和面关节等二关节的修复和再生，其中特别强调了基于细胞的产品。介绍了体外和小动物研究的进展，包括细胞来源、生物活性刺激、支架或无支架方法，并讨论了设计软骨以抵御炎症环境的新技术。考虑了监管、生产、资金和知识产权问题，总结了临床开发中的产品，并描述了研究人员在开发和转化未来疗法时必须克服的挑战。
【全球软骨修复产品现状】
从历史上看，修复受损或退化软骨的治疗方法的开发一直具有挑战性，部分原因是软骨组织的表型和原生软骨组织必须承受的条件。微骨折是指在软骨下钻孔以释放骨髓并诱导软骨修复，于 1959 年首次提出，自 20 世纪 90 年代起被广泛使用；然而，微骨折产生的修复组织由 I 型胶原组成，与原生组织相比，其机械性能和耐久性较差。自ACI于 1994 年首次应用。这种方法需要进行两次手术，从健康组织中分离出细胞，经过扩增后再植入同一患者体内。这种方法后来更新为基质诱导 ACI（MACI），即在植入前使用支架为软骨细胞播种。虽然MACI已在临床上使用，但供体部位的发病率和需要两次手术是这些技术的主要缺点。软骨修复的历史背景已在其他文献中回顾。由于以往治疗方法的缺点，需要开发新的疗法来治疗软骨退化。
【软骨组织工程的进展：台式和小型动物】
软骨组织工程在体外台式研究和小动物体内研究（通过小鼠和大鼠皮下植入，以及大鼠和兔子正位植入）方面取得了进展，涉及细胞来源、细胞刺激、支架开发和无支架方法等相关领域（图 1）。
异体方法克服了自体软骨产品所面临的挑战，其优势在于避免对健康软骨的损害，避免了多次手术的需要，缩短了诊断和治疗之间的时间。生产规模直接影响异体组织工程软骨产品的可转化性；如果没有可扩展的方法来培养大量细胞，工程软骨可能无法满足寻求治疗者的需求。有限的供体组织和扩增过程中软骨细胞的再分化进一步挑战了基于细胞的产品的转化。克服这些障碍的方法包括使用替代细胞来源，如诱导多能干细胞（iPSCs）、间充质基质细胞（MSCs）、脂肪源性干细胞（ASCs）和软骨祖细胞（也称软骨源性祖细胞），以及恢复扩增软骨细胞软骨形成能力的技术。
为改善新软骨构建物的功能特性，实现关节功能的长期恢复，已开发出工程软骨刺激方案，其中包括：生化刺激（培养基中的化学添加剂）；机械刺激（对组织进行物理操作，通过机械传导增强功能特性）；以及基因操作（修改细胞中的基因靶点，改善工程软骨）。
软骨组织工程支架开发的进展包括使用电纺丝、3D生物打印和3D编织。电纺丝是一种纤维生产方法，通过在多层结构中堆叠水平、随机和垂直排列的聚己内酯纤维，可用于制造模仿软骨组织内部结构的各向异性支架。电纺丝还能在聚己内酯支架中加入软骨衍生基质，与仅使用聚己内酯的对照组相比，电纺丝更能刺激种子 ASCs 产生 GAG 和胶原蛋白。在3D生物打印中，有一种方法使用的透明质酸经过修饰后可与降冰片烯官能团光交联。在生物打印支架中包裹的间充质干细胞产生了凝胶凝集素和 II 型胶原蛋白，这表明间充质干细胞产生了软骨。另一种创建支架的三维生物打印方法使用了一种基于 4% 胶原蛋白和软骨细胞的生物墨水，将其植入大鼠皮下后可产生 GAGs 和 II 型胶原蛋白。3D编织是在软骨支架中制造独特结构的另一种方法。一项研究采用多种方法将3D编织聚己内酯纤维、间充质干细胞和存活骨结合起来，形成同时具有骨和软骨间充质干细胞表型的骨软骨构建物。另一种方法是利用3D编织聚己内酯支架形成骨软骨构建体，方法是向间充质干细胞补充 TGFβ3，以驱动软骨生成，同时过表达 RUNX2，并通过 RNA 干扰抑制另一个间充质干细胞亚群中的 SMAD3，以诱导基质矿化。
图1 关节软骨组织工程策略
【炎症环境工程】
尽管迄今为止大多数软骨组织工程策略都是为治疗急性软骨缺损而开发的，但在开发治疗慢性 OA 和 RA 等病症的植入物时，必须考虑调节炎症环境的方法。随着关节退行性病变的发展，免疫系统会被激活（包括巨噬细胞、T 细胞、B 细胞的聚集和促炎细胞因子的产生），关节内会发生各种病理变化（如骨痂和骨质增生的形成）（图 2）。虽然组织工程有望修复受损的软骨组织，但如果不进行干预，潜在的炎症环境持续存在，植入物可能会与受损的原生组织一样走向死亡。
本文介绍了用于调节 OA 和 RA 炎症的成熟和新兴抗炎方法，还介绍了使用免疫调节生物材料和合成生物学的组织工程方法（图 2），这些方法被归类于新兴的“组织免疫工程”领域，该领域存在于免疫工程和组织工程的交叉点。软骨组织免疫工程将免疫调节策略与工程软骨植入物相结合，开发关节炎的治疗方法，目的是确保植入物在植入后能承受和/或调节关节的炎症环境。软骨组织免疫工程的这一新模式旨在将治疗方法转化为针对大面积缺损或患有 OA 或 RA 的整个关节的治疗方法，而不仅仅是针对病灶性软骨缺损的治疗方法。
在治疗 OA 和 RA 时， NSAIDs和 DMARDs 等抗炎药物被广泛使用。由于非特异性的全身用药可能会导致脱靶效应，而无法治疗关节内潜在的退行性病变，因此关节内皮质类固醇注射通常被用来有针对性地减轻炎症。另外，由于间充质干细胞具有潜在的免疫调节特性，因此也有人尝试将其作为一种改善关节炎状况的方法。然而，由于没有载体，目前还不清楚细胞注射在关节内的存留时间。例如，一项II/III期临床对照试验结果表明，无载体细胞注射并不比糖皮质激素注射更有优势。因此，为解决滞留问题，人们开发了可持续释放生物活性药物和生物制剂的载体。2024 年关于免疫工程治疗潜力的综述深入讨论了这些技术。在软骨组织工程方面，将给药载体和生物材料与组织工程策略相结合，可能会产生有助于植入物存活的新疗法。
为了使组织工程植入物能够承受炎症环境，目前正在开发可减轻免疫介导的软骨植入物退化的免疫调节生物材料。例如，由于硫酸软骨素可能具有免疫调节特性，人们开发了一种丝纤维素-硫酸软骨素支架，并在体外试验中证明这种支架可减少对 IL-1β 的炎症反应。在另一项研究中，通过添加 IL-4 改变脱细胞软骨 ECM，可调节 M1-M2 型巨噬细胞的分布，促进大鼠膝关节骨软骨缺损模型的愈合。由酪氨酸修饰的透明质酸与蚕丝纤维素组合而成的生物材料可装载抗炎药物，用于药物输送和组织工程应用，在体外可持续释放抗炎药物 60 天。尽管免疫调节生物材料可能有助于开发针对 OA 的疗法，但在软骨组织工程方面，尚未在大型动物实验中对其进行评估。不过，这些基于支架的技术的进一步发展可能会导致免疫调节因子的持续释放，从而延长植入物在发炎关节中的寿命。
对抗退化关节免疫反应的一种方法是利用合成生物学，通过改造和操纵细胞机制来产生免疫调节。例如，利用慢病毒基因递送技术改造间充质干细胞，使其过度表达 IL-1 受体拮抗剂（IL-1Ra），从而使组织工程软骨构建体在体外受到 IL-1 的炎症挑战时仍能保持机械性能。这项技术还得到了进一步发展，将慢病毒载体附着在播种有人类 ASCs 的三维编织聚己内酯支架上，以减轻 IL-1 暴露的有害影响。另一种合成生物学方法涉及改造软骨细胞，使其分泌抗炎细胞因子以应对机械刺激。具体来说，通过利用对渗透压敏感的 TRPV4 信号通路，IL-1Ra 的分泌在渗透压作用下被上调，从而产生了一种通过产生抗炎因子来应对病理负荷的植入物。到目前为止，以 IL-1 为靶点的研究已在软骨组织免疫工程领域取得了可喜的进展，但在未来的研究中可能还需要以其他炎症通路为靶点。
图2 炎症环境中组织工程软骨的方法
【软骨组织工程的转化】
一旦在体外开发出组织工程软骨治疗方法，在临床应用之前必须克服转化载体的许多方面（图 3）。本文概述了软骨产品的大动物研究、适用于软骨产品的全球监管环境现状（以美国监管途径为例）、生产问题、知识产权和资金方面的考虑因素，以及已获批准和处于临床开发阶段的软骨产品。
要进行转化载体研究，软骨植入物应先在大动物模型中进行安全性和有效性评估，然后才能进行首次人体研究。在这些研究中，猪、山羊和绵羊动物模型最常用于膝关节，这与监管机构和科学协会的建议一致。颞下颌关节则使用猪模型。使用的方法有自体、异体和异种。学者们对膝关节和髋关节软骨和骨软骨缺损的修复进行了研究，对半月板和颞下颌关节盘纤维软骨缺损的修复进行了研究。只有两项研究采用了GLP或GMP。虽然其中许多研究报告了成功的软骨修复或再生，但证据大多是半定量的组织学和大体形态计量学评分；大多数研究没有对修复后的软骨进行机械或生化分析。
在全球范围内，在过去的二十年中，监管组织工程软骨产品的管理机构通过法案、法规和指导性文件制定了相关政策。一般来说，全球监管指南的制定是为了应对组织工程领域的科学创新（如新型细胞来源、支架和无支架技术以及基因编辑技术）、围绕产品在人体中使用失败的严重不良事件（包括未经证实的干细胞疗法和未经证实疗法的标签外使用）以及通过优先审查途径和有前景疗法的临时审批途径加快监管审批程序的愿望。总体而言，监管准则旨在确保公众安全，同时兼顾加快转化新型疗法以满足 OA 和 RA 等疾病中尚未满足的医疗需求的愿望。
图3 组织工程软骨产品的转化载体
2. 总结与展望
软骨组织工程领域正处于一个关键的转折点，组织工程学的进步，如异体细胞源的出现和生物仿生构建物的组织工程学，最终都将转化为现实。虽然目前在全球特定地区有少数几种产品，但还没有基于细胞的软骨产品可用于患有严重 OA 或 RA 的关节。将新的软骨修复疗法推向市场需要科学价值和转化载体。目前对转化的重视和不断变化的监管环境可能预示着新一代疗法的诞生，以治疗各种软骨适应症。
文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41584-024-01118-4